植物内生菌是发现活性天然产物的重要资源，目前已从内生菌中分离鉴定了一系列具有显著活性的天然产物，如具有动物神经*性的麦角生物碱和吲哚生物碱，具有植物抗*素样作用的细胞松弛素等[1-2]。另一方面，内生真菌在和宿主长期共生的过程中，可能产生与宿主相同或相似的代谢产物，如发现了能够产生喜树碱、*臼*素、紫杉醇等活性天然产物的内生菌[3-4]。因此，从内生菌中寻找活性天然产物或筛选能够产生特定活性成分的菌株成为当前研究的热点。

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.exMurray)Trev.为石杉科石杉属多年生草本蕨类植物，全草具有散瘀消肿、清热解*的功效。从蛇足石杉中分离得到的石杉碱甲是一个高效、可逆、高选择性的 酯酶抑制剂，用于治疗老年痴呆等神经退行性疾病[5]。研究表明，蛇足石杉各组织中存在丰富的内生菌，部分内生真菌可以产生石杉碱甲[6-7]。为了从内生菌中筛选活性天然产物，并寻找能够产生石杉碱甲的内生真菌，本课题组对蛇足石杉中的内生真菌及其代谢产物进行了系统研究，发现了一系列结构新颖的化合物[8-9]。本实验报道从蛇足石杉内生真菌PenicilliumchrysogenumMT-12中分离得到的8个 醚类化合物，分别为*青霉内酯A（penicichrysogenillideA，1）、*青霉内酯B（penicichrysogenillideB，2）、talaromyoneA（3）、isopenicillide（4）、penicillide（5）、hydroxypenicillide（6）、purpactinA（7）、*青霉内酯C（penicichrysogenillideC，8）。其中化合物1、2为新化合物，化合物3为首次从青霉属中分离得到，化合物4～8为首次从产*青霉菌中分离得到。化合物1、2对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW.7的NO产生具有一定抑制活性，而所有化合物在浓度为μmol/L时对 酯酶不显示抑制活性。

AutopolIV全自动旋光仪（美国Rudolf公司）；UV-PC紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；FT-IR红外光谱仪（美国Thermo公司）；JASCOJ-圆二色光谱仪（日本JASCO公司）；高效液相离子阱飞行时间质谱分析系统：UFLCSIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPDM20A紫外检测器，LC-20ADXR泵，IT-TOF-MS配备ESI离子源（日本Shimadzu公司）；Varian核磁共振仪（美国Varian公司）；Waters半制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ODS半制备柱（SunFireTMC18，mm×10mm，5μm）；SephadexLH-20填料（瑞典AmerashamBiosciences公司）；ODS柱色谱填料（Li-ChroprepRP-C18，40～63μm，德国Merck公司）；D大孔树脂、柱色谱用硅胶（～目）及薄层色谱用GF硅胶预制板均为青岛海洋化工厂生产。MCO-18AIC细胞培养箱（日本SANYO公司）；AE0倒置荧光显微镜（中国Motic公司）；OptiMair超净台（新加坡ESCO公司）；M0型多功能酶标仪（美国TECAN公司）；DMEM培养基（美国Hy-clone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；NO化学法试剂盒（南京建成生物公司）；吲哚美辛、 、5,5-二 二 苯 、二 亚砜、十二 钠均由Sigma公司提供。石杉碱甲、电鳗 酯酶由上海源叶生物公司提供。

蛇足石杉Huperziaserrata(ThunbexMurray)Trev.采自福建省南平市（标本编号207）。本研究所用菌株由课题组自蛇足石杉中分离，根据其形态特征及ITSrDNA序列（GeneBankMF）鉴定为产*青霉菌PenicilliumchrysogenumMT-12，菌种存于北京中医药大学中药现代研究中心。

RAW.7巨噬细胞由中国中医科学院细胞中心提供。

P.chrysogenumMT-12于无菌环境下接种至0.5L×40瓶糙米培养基中，室温培养40d后，用 浸提3次，减压回收得提取物60g。经硅胶柱色谱， - （1∶0→1∶1）梯度洗脱，合并得8个流分（Fr.A～H）。Fr.D经反相硅胶柱色谱， -水（2∶8→10∶0）洗脱得到8个部位（SFr.DA1～DA8）。SFr.DA7经SephadexLH-20柱色谱， - （1∶1）等度洗脱得到3个流分（SFr.DA7S1～DA7S3）。SFr.DA7S2经半制备高效液相色谱，乙腈-水（9∶11）等度洗脱得到化合物1（8.0mg）、2（3.5mg）、3（7.2mg）、4（8.8mg）。SFr.DA6经半制备高效液相色谱，乙腈-水（11∶9）等度洗脱得到化合物5（6.5mg）、6（12.4mg）、7（5.5mg）、8（4.6mg）。

化合物1：*色粉末，[α]21D+28.0°(c0.1,MeOH)。(nm):(4.10),(3.75)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z.[M－H]?（计算值.），结合其13C-NMR数据确定其分子式为C21H24O7。IR图谱显示该化合物结构中含有 （cm?1）、羰基（cm?1）和苯环（、8cm?1）。1H-NMR显示4个芳香氢信号δH7.50(1H,d,J=8.5Hz,H-2),6.79(1H,d,J=8.5Hz,H-1),6.81(1H,d,J=2.0Hz,H-10),6.31(1H,d,J=2.0Hz,H-8)；2个含氧亚 信号δH5.08(1H,d,J=14.5Hz,H-7a),4.98(1H,d,J=14.5Hz,H-7b),3.56(1H,dd,J=10.5,4.0Hz,H-4′a),3.49(1H,dd,J=10.5,4.0Hz,H-4′b)；1个亚 信号δH1.73(2H,t,J=6.0Hz,H-2′)；1个含氧次 信号δH5.12(1H,t,J=6.0Hz,H-1′)；1个次 信号δH1.79(1H,m,H-3′)；2个 信号δH2.20(3H,s,1″-CH3),0.91(3H,d,J=6.8Hz,5′-CH3)；1个甲 信号δH3.91(3H,s,4-OCH3)。化合物1与已知化合物penicillide的NMR数据非常相似[10]，提示两者具有相同的结构骨架。然而，化合物1的1H-NMR数据与penicillide（5）相比少了1个 信号，而多出1个含氧亚 信号δH3.56(1H,dd,J=10.5,4.0Hz,H-4′a),3.49(1H,dd,J=10.5,7.0Hz,H-4′b)。13C-NMR谱中，化合物1的C-4′化学位移明显向低场位移(δC67.7;ΔδC+45.9)，提示化合物1中C-4′被氧化为羟 。此外，H1-1′/H2-2′、H2-2′/H1-3′、H1-3′/H2-4′、H1-3′/H3-5′之间的1H-1HCOSY相关以及H2-7/C-5、H2-7/C-8、H2-7/C-12、H-1′/C-2、H-1′/C-4、H-1″/C-8、H-1″/C-9之间的HMBC相关（图1），进一步证明上述推断。结合2DNMR图谱如HSQC、1H-1HCOSY及HMBC，对化合物1的所有氢碳信号进行归属（表1），确定化合物1的平面结构如图1所示，为新化合物，命名为*青霉内酯A。

化合物2：淡*色粉末，[α]21D?4.0°(c0.1,MeOH)，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z.[M－H]?（计算值.），结合其13C-NMR数据确定其分子式为C21H24O7。化合物2的1H-NMR及13C-NMR与化合物1非常相似（表1），仅是C-3位的取代基（3- -1,4-丁二醇基）上的碳氢信号略有差别，提示化合物1和2可能为一对立体 。利用2DNMR（1H-1HCOSY、HMBC及HSQC）对化合物2的氢碳信号进行归属，确定其平面结构与化合物1完全相同（图1）。

化合物1和2的CD谱中，在nm(Δεmax?8.0)出现负的Cotton效应，在nm(Δεmax+3.0)出现正的Cotton效应，在nm(Δεmax?0.5)出现负的Cotton效应，这与文献报道的化合物hydroxypenicillide[11]的CD图谱完全一致，因此确定化合物1和2中C-1′的 构型均为S构型。C-3′的 构型主要根据文献报道进行确定[12]，当C-1′为S构型时，如果C-3′为R构型，H-3′和3′-CH3的化学位移相对于C-3′为S构型处于相对高场，H-1′的化学位移对于C-3′为S构型处于相对低场。据此，确定化合物1的 构型为1′S,3′R。化合物2的 构型为1′S,3′S，命名为*青霉内酯B。

化合物3：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C21H24O6。1H-NMR(MHz,CDCl3)δ:7.03(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.58(1H,d,J=8.5Hz,H-2),7.02(1H,brs,H-7),7.06(1H,brs,H-9),4.89(2H,s,H-13),5.07(1H,dd,J=9.5,4.0Hz,H-1′),1.65(1H,m,H-2′a),1.45(1H,m,H-2′b),1.77(1H,m,H-3′),0.98(3H,d,J=6.5Hz,4′-CH3),0.95(3H,d,J=6.5Hz,5′-CH3),3.90(3H,s,4-OCH3)；13C-NMR(MHz,CDCl3)δ:.9(C-1),.1(C-2),.0(C-3),.3(C-4),.5(C-4a),.8(C-5),.8(C-6a),.8(C-7),.5(C-8),.1(C-9),.5(C-10),.5(C-10a),.1(C-11a),21.0(C-12),60.3(C-13),67.0(C-1′),47.6(C-2′),25.1(C-3′),22.0(C-4′),23.5(C-5′),63.0(4-OCH3)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化合物3为talaromyoneA。

化合物4：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C21H24O7。1H-NMR(MHz,CDCl3)δ:6.90(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.72(1H,d,J=8.5Hz,H-2),5.08(2H,m,H-7),6.38(1H,brs,H-8),6.86(1H,brs,H-10),5.40(1H,dd,J=9.5,2.0Hz,H-1′),1.79(2H,m,H-2′),1.48(3H,s,4′-CH3),1.31(3H,s,5′-CH3),3.97(3H,s,4-OCH3),2.24(3H,s,1″-CH3)；13C-NMR(MHz,CDCl3)δ:.7(C-1),.2(C-2),.8(C-3),.1(C-4),.0(C-4a),.5(C-5),69.2(C-7),.9(C-7a),.7(C-8),.2(C-9),.7(C-10),.4(C-11),.5(C-12),.4(C-12a),66.3(C-1′),49.5(C-2′),72.5(C-3′),27.7(C-4′),32.4(C-5′),62.6(4-OCH3),21.0(C-1″)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物4为isopenicillide。

化合物5：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C21H24O6。NMR数据见表1，故鉴定化合物5为penicillide[10]。

化合物6：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C21H24O7。1H-NMR(MHz,CDCl3)δ:6.88(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.58(1H,d,J=8.5Hz,H-2),5.11(2H,s,H-7),6.60(1H,d,J=2.0Hz,H-8),7.04(1H,d,J=2.0Hz,H-10),5.09(1H,dd,J=9.5,4.0Hz,H-1′),1.68(1H,m,H-2′a),1.48(H,m,H-2′b),1.80(H,m,H-3′),0.99(3H,d,J=6.5Hz,4′-CH3),0.97(3H,d,J=6.5Hz,5′-CH3),3.98(3H,s,4-OCH3),4.59(2H,s,H-1″)；13C-NMR(MHz,CDCl3)δ:.6(C-1),.2(C-2),.2(C-3),.8(C-4),.9(C-4a),.4(C-5),69.1(C-7),.4(C-7a),.6(C-8),.9(C-9),.7(C-10),.9(C-11),.9(C-12),.2(C-12a),66.9(C-1′),47.8(C-2′),25.2(C-3′),23.6(C-4′),22.0(C-5′),62.9(4-OCH3),64.6(C-1″)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物6为hydroxypenicillide。

化合物7：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C22H24O7。1H-NMR(MHz,CDCl3)δ:6.87(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.44(1H,d,J=8.5Hz,H-2),5.12(1H,d,J=8.5Hz,H-7a),5.01(1H,d,J=8.5Hz,H-7b),6.38(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.85(1H,d,J=2.0Hz,H-10),6.12(1H,dd,J=9.5,4.5Hz,H-1′),1.77(1H,m,H-2′a),1.49(1H,m,H-2′b),1.65(1H,m,H-3′),0.95(3H,d,J=6.5Hz,4′-CH3),0.95(3H,d,J=6.5Hz,5′-CH3),4.03(3H,s,4-OCH3),2.06(3H,s,1′-OAc),2.24,(3H,s,1″-CH3)；13C-NMR(MHz,CDCl3)δ:.8(C-1),.8(C-2),.4(C-3),.8(C-4),.0(C-4a),.2(C-5),69.1(C-7),.0(C-7a),.0(C-8),.3(C-9),.7(C-10),.4(C-11),.4(C-12),.7(C-12a),68.8(C-1′),45.5(C-2′),25.1(C-3′),22.0(C-4′),23.2(C-5′),62.8(4-OCH3),.4(1′-OCOCH3),21.3(1′-OCOCH3),21.0(C-1″)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物7为purpactinA。

化合物8：淡*色粉末，ESI-MSm/z:[M－H]?，分子式为C21H22O6。1H-NMR(MHz,CDCl3)δ:6.94(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.68(1H,d,J=8.5Hz,H-2),5.12(2H,m,H-7),6.40(1H,brs,H-8),6.87(1H,brs,H-10),2.84(2H,d,J=8.5Hz,H-2′),2.21(1H,m,H-3′),0.96(3H,d,J=6.5Hz,4′-CH3),0.96(3H,d,J=6.5Hz,5′-CH3),3.97(3H,s,4-OCH3),2.25,(3H,s,1″-CH3)；13C-NMR(MHz,CDCl3)δ:.9(C-1),.8(C-2),.7(C-3),.5(C-4),.5(C-4a),.8(C-5),69.1(C-7),.9(C-7a),.1(C-8),.7(C-9),.9(C-10),.4(C-11),.9(C-11a),.0(C-12a),.6(C-1′),52.0(C-2′),29.9(C-3′),22.8(C-4′),25.1(C-5′),63.9(4-OCH3),21.0(C-1″)。故鉴定化合物8为penicichrysogenillideC[14]。

将处于对数期的RAW.7细胞用胰酶消化，然后用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基终止消化，并将细胞稀释到4×个/mL，接种到96孔板中，细胞/孔，CO2培养箱孵育24h。用二 亚砜（DMSO）将单体化合物配制为20mmol/L浓度母液，然后用培养基稀释后加入96孔培养板至终浓度为、20、4μmol/L，孵育1h，再加入LPS至终质量浓度为1μg/mL，继续孵育24h。从96孔板各孔中吸取μL上清至酶标板内，每孔加入50μLGriessR1，室温避光放置5min，再加入50μLGriessR2，室温避光放置5min。nm测定吸光度，计算各化合物对NO分泌的抑制率，抑制率＞50%的浓度为半数抑制浓度（IC50）。在上述96孔板中加入25μL的MTT至终质量浓度为0.5mg/mL，CO2培养箱内孵育4h。各孔加入μL三联液（10g十二 磺 、5mL异 、0.1mL浓 ，用蒸馏水定容到mL），待甲瓒充分溶解后测定nm吸光度，并计算化合物对RAW.7细胞生长的抑制率[15]。

化合物1和2对NO产生具有一定抑制作用，IC50分别为（72.6±2.3）、（41.2±1.4）μmol/L，阳性对照吲哚美辛IC50为（33.6±1.4）μmol/L。此外，对化合物1～8进行 酯酶抑制活性筛选[16-17]，所有化合物在浓度为μmol/L时对 酯酶不显示抑制活性。

参考文献（略）

来源：张鑫，齐博文，杨洪芸，江芳芳，丁宁，吴云，刘晓，屠鹏飞，史社坡.蛇足石杉内生真菌PenicilliumchrysogenumMT-12中2个新 醚类成分[J].中草药,8,49(11):-.