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初稿：张世曦编辑：佳佳
三维生物打印是一种极具吸引力的构建组织的方法。然而，生物打印微型组织块(即组织球)，并对其在三维空间中的定位进行精确控制，一直是三维生物打印的一个主要瓶颈。
日前，一篇来自《ScienceAdvances》的文中，有科学家研发了一种新型生物打印技术，这为突破 定位微型组织球这一难题，带来了新的进展。
通讯作者是:BugraAyan教授,和DongNyoungHeo教授
摘要：文中，作者研发了“吸气辅助生物打印(AAB)”技术。通过利用吸力的力量，可以在3D中提取并生物打印生物制品。当与微阀生物打印相结合时，它促生了各类不同的生物制造方案，包括基于支架或无支架、以及之前未曾达到的放置精度（相对于球形尺寸约11%）的生物打印技术。本文研究了AAB的潜在物理机制，并阐释了在生物打印过程中，吸起粘弹性组织球的力和物理控制力之间的相互作用。本文生物打印了各种尺寸的生物材料，包括组织球(80~mm)、组织链(~mm)或单细胞(~mm)。在应用方面，本文展示了血管生成芽状纹路的组织球和成骨组织球的自组装过程。
前言：含有多种优势的组织球是3D生物打印中一个很好的候选构件，但现今只有少数几种方法被用于组织球（由细胞构成）的3D生物打印制造，包括挤压式生物打印，基于液滴的生物打印，Kenzan制造方法和生物ogripper制造方法。文中使用的所有现有组织球生物打印技术都存在着定位精度和打印精度的问题，可能严重影响组织球的生物、结构和力学性能，并阻碍了使用相同大小的组织球来进行生物打印的成功实现。
本文中，作者提出了一种新的混合式生物打印方法，通过利用吸力的力量，能够在80至mm范围内，以最小的细胞损伤将构件放置到凝胶基质上，挑选并精确地打印多种生物材料。为了更好地理解生物制品对生物打印过程的响应，本文揭示了粘弹性组织球的物理行为及其在吸起、拾起和生物打印过程中与物理控制力相互作用的潜在机制。与上述方法相比，本文中所用方法的定位精度和打印精度更高。
此外，它可以灵活地将非均匀的任意大小组织球打印到(i)功能性凝胶（基于支架的方法）或(ii)牺牲凝胶（无支架方法）中，从而实现3D生物打印。它由MakerBotReplicator1(美元)改装而成，操作一个定制的玻璃移液管，用于“拾取”生物制剂并将其“3D生物打印”到凝胶基底上。将AAB与微阀相结合，以液滴为基础，生物打印功能性或牺牲性水凝胶。为了将球体生物打印成功能性水凝胶(即纤维蛋白)，作者通过微阀生物打印纤维蛋白原和凝血酶层以获得纤维蛋白结构。在完全交联之前，组织球被打印到想要的位置。
为了在牺牲性水凝胶(即海藻酸盐)上生物打印组织球，使用了微阀生物打印和气溶胶交联工艺。首先在玻璃基底上生成海藻 液滴；其次，利用 钙(CaCl2)烟雾进行即时交联，然后挑选出组织球并将其3D生物打印到部分交联的海藻酸盐上；接下来，用海藻 液滴覆盖打印区域；之后，再次以气雾剂形式施加CaCl2。根据需要，重复这个过程来构建其他层。接下来，将生物打印的组织球暂时保存在支持凝胶中，直到实现部分融合。 ，使用裂解酶溶液通过交联除去支撑凝胶。
图1
文中，作者提出的方法为生物打印几种组织类型的组织球和各类组织球堆叠铺平了道路，本文列举了在2D和3D凝胶基质中的多种应用，包括(i)生理相关培养环境的开发，以证明组织球在支架培养基中的集体血管生成发芽行为，以及(ii)成骨组织的制备，以了解干细胞基组织球中期成骨诱导(生物打印前)的矿化作用，以及无支架环境中的组装行为。
正文部分：
1.AAB的工作机制
图2
在AAB过程中， 步是挑选一个组织球，然后通过吸力将其举起并快速拖出培养基，如图2A所示。组织球应在不破坏或损坏的条件下，以最小的吸力捕获、转移。在施加应力(s)的吸起过程中，它表现出粘弹性。生物打印时间比松弛时间短时，它表现出的像固体一样的弹性；比松弛时间长时，表现出像流体一样的弹性。这可以用麦克斯韦模型来描述：
（1）
ε为应变，l为弹性模量。在这一过程中，遇到了两个问题。 ，由于细胞内聚性和弹性较低，即使在非常低的压力水平下，组织球也容易破碎。第二，在拾起过程中观察到组织球在三相接触(空气-液体-组织)处从移液管 分离。前者可以通过组织球工程获得更好的弹性特性来缓解，而后者可以通过确定最小吸压来解决。组织球克服重力、浮力、水力阻力和界面处的热力学障碍后，由移液管利用吸力拾起。拾起的主要困难是由培养基与空气交界面表面张力引起的结合能。在三相(组织、空气和介质)接触线上，组织球以接触角的形式阻碍提升。将一个组织球提升到空气中的能量势垒表示为：
（2）
式2中As为组织球表面积，s1,2为介质与空气之间的表面张力，qd为三相接触线上的接触角。在拾起过程中，由于动力学效应，三相接触角(动态接触角)大于静态接触,可以通过添加几何修正因子(m)来估计能量势垒。m可以定义为：
（3）
式3中，Rp为移液管 半径，Rs为椭球半径。当组织球半径远大于移液管 半径时，m可近似为1。然而，当吸起一个小球或组织球半径与移液管的半径相当时，m会变得小得多。因此，组织球脱离介质的临界升压可表示为：
（4）
临界升压与介质-空气界面的表面张力系数、组织球半径、三相接触线上的动态接触角和移液管的锥形角成正比。
为了展示组织球的选取和拾起，本文培养制备了一系列具有不同粘弹性和表面张力的组织球。采用扫描电子显微镜(SEM)对组织球的超微结构进行分析。结果显示，不同组织球的表面形貌和致密性存在明显差异(图2C)。表面张力系数可以根据Young-Laplace方程
来估计。图2D表明，组织球表面张力与其致密性之间存在正相关。图2E表明，不同球粒中归一化的胶原含量与球粒的致密性变化趋势相似，然而没有观察到3T3、4T1和HDF组织球归一化胶原含量之间的显著差异。
图2F为临界升压与组织球直径(~mm)之间的线性关系。随着组织球直径的增大，临界升压也随之增大。使用公式4确定了不同直径下每种组织球的理论临界提升压力，其中4T1的临界升压理论值 ，可以作为其他组织球测试的基线。此外，组织球(~mm)的最小临界升压为~19mmHg。临界升压的理论值和实验值之间的差异是由于(i)组织球不规则形状(影响 能量势垒)和(ii)压力传感器的测量误差(约为10%)。
生物打印成功的另一个重要因素是确定组织球的粘弹性，这可以通过应力和应变随时间的关系来反映。如图2G所示，HUVEC、4T1和MSC/HUVEC的弛豫时间约为3-5分钟。HDF的弛豫时间可达18分钟。在AAB中，由组织球拾取和生物打印之间的时间通常小于30s。总的来说，不需要组织球 变形，生物打印过程也能成功进行。
在AAB中，生物打印是否成功由移液管 的持续粘附(向上，Fup)和凝胶界面的可变生物打印力(向下，Fdown)决定的。为确定Fup，定义了两个角度:b1=arccosRp/Rs，b2为移液管锥角。Fup=2pRpgscos(b1+b2)，其中gs为组织球表面张力。Fdown=2pRsggcos2(q1/2)2,其中gg为凝胶的表面张力，q1为润湿的有效角度。如图3A2所示，生物打印需要满足FdownFup。然而，如果组织球没有完全恢复(当组织球迅速浸入凝胶中)，移液管 可能会有一个额外的应力(Fext)，Fdown需要克服Fext+Fup，这可能会增加生物打印的难度。
凝胶溶液的表面张力因凝胶而异。在一些凝胶中（如海藻酸），表面张力依赖于浓度;然而，有些水凝胶的表面张力不依赖于浓度，例如聚 。因此，本文不能对浓度与表面张力之间的关系作出表述。
2.AAB在生物制品的绘图和3D生物打印方面的能力
图3
作者通过不同形状的图案(相对于组织球平均大小约11%)(图A1到A3)、以及直径为80~mm的各种形状和尺寸的组织球矩阵(图3A4)，证明了AAB在藻酸盐上精确生物打印组织球的能力。
此外，作者还将绿色荧光蛋白(GFP)标记的三角形和环状间充质干细胞组织球打印到包括I型胶原(COLI)和 明胶(GelMA)在内的其他凝胶中(分别为A5和A6所示)。为了突出AAB的精度，作者在没有任何凝胶支撑的情况下，生物打印了8个不同大小的间充质干细胞组织球(A7和A8)的柱状结构。这是通过在每一层交替对凝胶和组织球进行生物打印来实现的，这就需要精确控制凝胶的厚度。
然而，凝胶的厚度取决于多个因素，如液滴的分辨率、交联时间和液滴的扩散行为，这些因素在微阀生物打印中也不是容易控制的。为了克服这一基本限制，自愈合的宾厄姆塑料支撑凝胶可用于凝胶内自由移动的组织球，这可能会为高度复杂的几何形状(包括中空结构)的自组装带来更大的灵活性。
此外，在预定的时间点上研究了球的自组装。如图3B1所示，将两个独立的3T3组织球近距离生物打印，为最小化表面能量，它们逐渐融合形成一个更大的组织球。在培养24小时后，接触长度和球间角增加了50%(图3B2)。
为了评价生物打印技术对组织球生存能力的影响，作者对2个方案进行了评价。在方案1中，将组织球取出并放入另一个细胞培养基中后，立即测定其生存能力。在方案2中，在将组织球打印到凝胶基质中后，对其生存能力进行评估。未进行生物打印的组织球被用作阳性对照组。阳性对照组和方案1的组织球存活率分别为94%和88%(图3B3)。在方案2中，组织球活力测定为82%。活力的下降可能是由于组织球在水凝胶底物中快速转移时的吸力、脱水或细胞损伤所致;然而，组织球生物打印的活力水平超过80%仍然可以被认为是中等水平的，因为即使没有生物打印，制备的细胞聚集型组织球活力也可能在这个范围内。
除了组织球的生物打印，AAB系统还可以用于其他生物制品的生物打印。将从电鳗中分离的电细胞进行生物打印，电细胞以串联的形式进行空间排列(类似于串联的电池;图3C1)。使用AAB在20-25mmhg的背压下挨个打印在琼脂糖上(图3C3)。图3D显示了组织链的垂直生物打印到针之间的距离，这可以用于制造可伸缩的肌肉、脂肪、软骨、神经、血管等组织。
图4
为了证明本方法的其他独特功能，作者对不同大小和类型的组织球进行了异质组织复合物生物打印(图4，A和B)。组织球被安排成金字塔结构，使用共聚焦成像来清晰地显示异质结构， 一个HUVEC被准确地放置在第三层三个相邻MSC(约为HUVEC的2.5倍)之间的狭窄空间中，清楚地展示了AAB技术独特的沉积能力。藻酸盐在培养初期保持了生物打印图案的结构完整性。此外，它使生物打印实体能够固定在生物打印之前确定的位置。从共焦图像(图4,C1到C6)可以明显看出，组织球连接良好。本文还展示了一个更复杂的模式,如菱形图案(图4D-G)。这是 个具有如此精度的组织球生物打印，在三维中产生相对于组织球大小约15%的高度复杂的几何形状和异质结构。
3.AAB技术的应用
图5
为了证明AAB在基于支架的生理相关培养环境制备中的应用，作者以预定距离将HUVEC生物打印到纤维蛋白水凝胶中，并研究了它们的集体血管生成发芽行为。值得重视的是，作者可以通过改变组织球的接近程度直接影响细胞-细胞信号，进而定制血管生成的萌芽行为。组织球之间的距离保持在、、mm(此处以孤立的组织球作为对照组)(图5A1)。在培养的初始阶段，相互接近的组织球与孤立的组织球相比，被认为具有更高的总血管长度(图5A2)。在总血管面积上也观察到类似的趋势。与其他两组相比，对照组萌发的毛细血管周围，其自由空间量是 的。
为了更好地了解组织球的位置是否影响它们的集体血管生成萌发行为，将GFP+和tdTomato+-HUVEC组织球分别以、和mm的间距生物打印到纤维蛋白凝胶中(图5B1)。然后进行了方向性分析，以探究血管生成发芽的方向性作用。作者注意到，一些毛细血管是由GFP+和tdTomato+-HUVECs共同形成的，如图B3所示，这可能是由于血管吻合或GFP+-HUVECs迁移到界面的另一侧造成的。结果表明，相互靠近的组织球会影响彼此的发芽行为，从而导致发芽体之间形成组织良好的网络。
作者将一个HUVEC组织球与一个GFP+-HDFs和MSCs共培养组织球(间隔控制距离)进行生物打印。结果表明，共培养球团中HDFs的密度越大，血管生成芽的方向性越好。MSC的存在对有血管生成HUVECs发芽产生了负面影响,这可能是由于MSC对血管生成有抑制作用。
图6
为了展示AAB的另一个主要应用，本文使用MSC/HUVEC组织球作为无支架结构的构建块，对成骨组织进行生物打印。
作者采用了两种不同的成骨分化培养方案，两种方案的成骨诱导总暴露时间相同。在 种方案中，将培养2天的组织球生物打印成三角形图案(图6A)，三角形图案中的类囊藻随着时间的推移产生自组装行为，组装后的结构在成骨培养基(OM)中进一步培养12天(图6,B和C)。如图6D所示，通过RUNX2和CD31的阳性染色，生物打印组织显示出成骨特异性并表达了内皮特异性标记物。茜素红染色也证实了成骨分化组织的钙沉积。如图6E所示，在成骨诱导12天后，特别是在自组装组织的核心，观察到了大量钙沉积。由于在MSC/HUVEC组织球融合后观察到大量收缩，原始的三角形形状没有得到保持(图6C)，而且矿化过程在整个组织边界呈不均匀分布(图6E)。
另一种方案保存了成骨组织的生物打印形状。MSC/HUVEC球形细胞先在GM中保存5天，然后在OM中诱导10天。接下来，对组织球进行生物打印，然后在OM中再保存2天。在培养结束时(图6F)，茜素红染色显示RUNX2表达较强。在用OM培养的3D生物打印组织中，虽然RUNX2在组织球中心染色较强，但矿化分布更均匀(图6，G-J)。RUNX2强度分析显示，RUNX2在组织核心或组织球界面处染色最强，在组装后的组织表面染色最弱(图6，K、L)。此外，观察到有限的形状变化。第二种方法中生物打印后的培养时间缩短，培养2天后的组织结构仍然稳定。本文还以GM培养的生物打印组织(标记为“GM培养的3D生物打印组织”)和2D分化12天的间充质干细胞(标记为“OM培养的2D间充质干细胞”)为对照组，分析了骨涎蛋白(BSP)、I型胶原(COL1)、碱性 酶(ALP)、RUNX2和CDH2(n-钙粘蛋白)基因在两种方案中的表达水平。如图6M所示，两种方法的BSP、COL1、ALP、RUNX2基因表达水平相似，且显著高于对照组。此外，所有3D生物打印组的CDH2基因(编码N-cadherin蛋白)表达水平相似，均高于2D对照组。总的来说，在相同的总诱导时间下，尽管成骨基因的表达水平没有差异，但通过改变成骨诱导窗口，可以控制生物打印组织的形状和矿化的均匀性。
结论：作者提出了一种更有效的AAB系统策略，利用一个简单易用、成本低(美元)和可再生的组织生物打印平台，可以在各种应用中发挥作用，包括但不限于器官芯片设备、药物测试设备、微流体、体外人类疾病模型、类有机工程、生物制造和组织工程、生物计算和生物物理学。然而，AAB系统需要进一步改进，以提高可伸缩组织制造的时间效率。在不久的将来，AAB平台可能会进一步发展，能够同时对一系列球体进行生物打印，以在更短的时间内进行大规模组织制造。
参考资料：
[1]Ayan,Bugra,etal."Aspiration-assistedbioprintingforprecisepositioningofbiologics."Scienceadvances6.10():eaaw.
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